一直以来,BD Rhapsody因为其温和的细胞捕获原理,而对脆弱细胞有着非常杰出的捕获能力,随着优秀科研成果的不断发表,这一能力也越来越受到众多科研专家和老师们的认可。
这不最近又新鲜出炉一篇高分佳作——由瑞金医院陈赛娟教授和沈柏用教授在《Gut》(IF=23.06)最新发表,对中性粒细胞在PDAC中的异质性和促肿瘤机制进行了深入探索与解析。
_ | 且值得一提的是,文中对BD Rhapsody平台的中性粒细胞捕获能力给予了明确的肯定,借此也希望给到其他进行粒细胞相关研究的老师更多参考。 |
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接下来,我们就一起来看看这篇文章的精彩解读吧!
胰腺癌是公认的最致命的恶性肿瘤之一,其5年生存率仅为9%,是名副其实的“癌王”。由于胰腺癌的高基质密度对T细胞浸润产生了物理屏障,因此现阶段的免疫检查点抑制剂和化学抗原体细胞受体疗效甚微。因此,针对先天免疫系统的治疗干预可能为目前PDAC免疫疗法的替代方案。
该研究提供了胰腺导管腺癌(PDAC)肿瘤微环境中性粒细胞的综合图谱。发现了驱动中性粒细胞朝向促肿瘤亚型的分子机制,该研究成果将有助于开发针对PDAC患者的新型免疫疗法,为“策反”中性粒细胞提供新的思路。
PART 01
单细胞测序实验设计
5名PDAC患者的外周血和PDAC组织、2名健康人(HC)的外周血、2名胰腺炎患者(CP)外周血样本,分离血液CD66b+中性粒细胞(PMN)和胰腺癌组织 CD45+免疫细胞。
PART 02
单细胞捕获平台
BD RhapsodyTM单细胞分析系统
PART 03
研究成果解析
中性粒细胞的异质性
基于前期队列研究发现,TANs在PDAC中大量浸润,且与PDAC患者预后不良相关。利用单细胞测序,研究者共检测到33891个外周血中性粒细胞和17932个胰腺癌免疫细胞的转录组,进一步划分8种细胞类型,其中中性粒细胞存在两个细胞群体:Neutrophils1存在于外周血样本,Neutrophils2仅存在于肿瘤组织中。CellphoneDB分析发现,相较于其他的免疫细胞,巨噬细胞与TANs间存在大量的配受体关系对,如CCL13-CCR1,CCL3-CCR1等,表明肿瘤微环境中两种细胞间的紧密相互作用,这也与免疫荧光染色中TANs和巨噬细胞间的物理距离接近的结果相互印证。
TANs异质性分析
为了进一步研究中性粒细胞的异质性,烈冰为研究者提供了subCluster分析,对PDAC患者的中性粒细胞细分,获得了6个PMN亚群和6个TAN亚群,PMNs表现出相似的表达特征,而TANs存在异质性:TAN-1亚群高表达血管生成因子VEGFA、促转移因子PLAU、LGALS3等,表现为促癌的特征;TAN-2与炎症相关(表达NLRP3、CD69和IL1RN等基因);TAN-3的基因表达特征和PMNs类似且高表达与中性粒细胞跨内皮迁移相关的基因(VNN2和SELL),说明TAN-3可能是迁移到肿瘤微环境中的过渡态细胞;而TAN-4特征性地高表达干扰素刺激基因。
TAN-1与PDAC患者不良预后相关
鉴于TAN-3的过渡态特征,研究者应用monocle2算法进一步构建了中性粒细胞状态轨迹的伪时间图,以PMN为分化的起点,逐渐转化为TAN-3过渡态,随后经过TAN-0和TAN-4的状态,最后达到终末分化状态TAN-2和TAN-1。研究者找到了1757个随拟时轴显著变化的基因并可归类为3种表达模式,其中第3组基因在肿瘤微环境晚期被激活,并在缺氧、糖酵解、内质网(ER)应激、IL-1和TNF信号通路等过程富集。进一步,研究者利用ER应激诱导剂(毒胡萝卜素 (THG)、促炎细胞因子IL-1β和TNFα以及缺氧的方式,体外刺激了中性粒细胞样分化的HL-60(dHL-60)细胞,发现内质网应激和缺氧是诱导中性粒细胞向TAN-1表型分化的关键因子。
此外,免疫荧光和免疫组化染色证实在PDAC微环境中存在上述4个亚群。有趣的是,VEGFA+ TANs(TAN-1)通常位于癌细胞附近,使其能够发挥促肿瘤功能,结合多个临床数据的进一步分析显示,VEGFA+ TANs和PDAC患者的不良预后显著相关。
糖酵解显著增强TAN-1的促肿瘤能力
考虑到代谢状态与免疫细胞的表型、功能息息相关,研究人员进一步分析中性粒细胞的代谢特征,并发现与其他中性粒细胞亚群相比,糖酵解和缺氧在TAN-1亚群中显著上调;流式细胞分选的LGALS3+ TAN(TAN-1)细胞中,葡萄糖转运蛋白GLUT1和糖酵解酶HK2、PFKFB3和LDHA的表达上调。为了进一步探索TANs代谢特征的空间分布规律,结合空间转录组测序技术,研究者发现相比于间质区,肿瘤和癌旁区域的中性粒细胞糖酵解活性显著上调,此外转录组测序、蛋白组和代谢组的多重分析均证实了相较于外周血PMN,TAN中糖酵解途径的显著富集。
那么糖酵解途径和TANs的促肿瘤功能有什么关联呢?基于LDHA是糖酵解途径的关键酶,也是TAN-1的关键标志基因,团队通过体外实验分析了过表达LDHA的dHL-60细胞的功能特征,结果显示过表达LDHA可使dHL60细胞促进肿瘤细胞生长、抑制T细胞免疫应答。
BHLHE40驱动中性粒细胞向促肿瘤表型发展
进一步,研究团队通过SCENIC软件分析驱动TANs异质性的上游转录因子,发现转录因子BHLHE40在TAN-1中显著表达,调控VEGFA、LGALS3、LDHA和BHLHE40等基因,促进中性粒细胞在肿瘤微环境中向促肿瘤的TAN-1表型分化。BHLHE40过表达和敲除后,受其调节的上述基因的表达量也呈现相应的上调或下调,说明BHLHE40是中性粒细胞向TAN-1表型极化的关键调节因子,染色质免疫沉淀实验也证实了BHLHE40对促肿瘤基因的直接转录调节作用。
此外,过表达BHLHE40的dHL-60细胞和PDAC癌细胞共培养后,癌细胞的增殖和迁移能力显著增强。免疫学实验显示,BHLHE40过表达抑制了CD8+ T细胞产生促炎细胞因子及淋巴细胞的增殖能力, BHLHE40+中性粒细胞的高浸润也与PDAC不良预后相关,说明BHLHE40是驱动中性粒细胞向促肿瘤和免疫抑制亚型分化的关键调控因子。
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全文总结
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总的来说,研究者利用单细胞测序、空间转录组测序、免疫荧光、免疫组化、代谢组、蛋白组、转录组分析等多种技术手段,揭示了胰腺导管腺癌中中性粒细胞的作用。鉴定出了一个中性粒细胞的促肿瘤亚群—TAN-1,揭示了TAN中高糖酵解活性与促肿瘤功能之间的关联,并证明了缺氧和ER应激诱导的BHLHE40激活可驱动TAN促肿瘤表型。
还记得之前有一期专门介绍BD Rhapsody 粒细胞 scRNA-seq 的介绍吗?
原文链接
doi:10.1136/gutjnl-2021-326070
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单细胞多组学平台
BD Rhapsody™
BD Rhapsody™ 单细胞多组学分析系统能够对成千上万个单细胞的蛋白与基因进行数字定量,提供灵活的定制化Panel及标准化应用方案,以满足不同的实验需求,其独特的混样技术可有效节约时间与成本。
系统组成包括:
BD Rhapsody™ 扫描仪
BD Rhapsody™ 上样台
BD Rhapsody™ cartridge(微孔板)
分子标签试剂和文库制备
全转录组检测试剂盒/靶向RNA检测试剂盒/定制试剂盒
Abseq蛋白检测试剂盒
多样本混样检测试剂盒
VDJ检测试剂盒
单细胞测序数据分析软件BD SeqGeq