热烈祝贺IsoSpark™用户——哈尔滨医科大学附属肿瘤医院生物治疗中心和南京爱比洛医药科技有限公司以共同第一作者在Pharmacological Research期刊（IF：9.4）发表最新研究成果！
文章提出一种新的以间皮素（mesothelin, MSLN）为靶点的CAR-UNKT细胞疗法，相比于CAR-T细胞抗肿瘤能力更强，为实体瘤免疫治疗提供了一种吸引人的替代疗法。研究者利用IsoSpark™功能蛋白分析平台和IsoCode单细胞分泌蛋白组芯片评估改造CAR- UNKT细胞的有效性。
文章亮点
１
通过IsoCode单细胞分泌蛋白组分析和细胞杀伤实验，发现UNKT细胞和修饰后的CAR-UNKT细胞具有较强的肿瘤细胞杀伤活性。
2
CAR-UNKT表现出比CAR-T更强的分泌功能及更高的细胞多功能指数（PSI），尤其是效应因子的贡献。
3
PSI结果提示UNKT细胞固有的抗肿瘤活性和CAR介导的特异性结合进一步增强UNKT的抗肿瘤活性，这与后续动物实验观察到的体内肿瘤抑制效果一致。
４
通过单细胞分泌蛋白组分析，发现CAR-UNKT细胞产生的IL-6更少，这提示可能会大大减少导致CRS的风险。表明CAR-UNKT细胞可能是传统CAR-T细胞的更安全、更有效的替代品。
研究背景
嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗是抗肿瘤免疫治疗中最热门的领域之一，也是近十年来免疫医学的重大突破。目前，靶向CD19的CAR-T细胞疗法在治疗血液肿瘤方面取得了显著成功，但在治疗实体瘤方面仍面临许多困难和挑战。
间皮素（Mesothelin，MSLN）是一种细胞表面糖蛋白，在间皮瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌等大多数肿瘤中高表达，而正常组织中很少表达。由于MSLN在正常组织和肿瘤组织之间的差异表达，MSLN成为实体肿瘤治疗的潜在靶点之一。
在这项研究中，作者报道了一种使用自然杀伤性T（NKT）细胞治疗实体瘤的新策略，该细胞对裂解多种癌症细胞系表现出强大的细胞毒性，对正常细胞安全，并且具有较低或无移植物抗宿主病活性，作者将其命名为universal NKT（UNKT）细胞。通过引入CAR介导的抗肿瘤机制，作者预计获得的CAR-UNKT将比UNKT具有更强的抗肿瘤功能。
Fig. 1. Graphical Abstract
研究思路
1. 筛选纯化UNKT细胞
从长期无复发癌症患者PBMC中筛选建立UNKT细胞株，鉴定UNKT对多种肿瘤细胞系、3D类器官和卵巢癌小鼠模型，均显示出有效的肿瘤杀伤作用，并能迁移到肿瘤组织；
2. 构建MSLN-CAR-UNKT细胞（Fig.2）和MSLN-CAR-T对照细胞
Fig. 2. Schematic representation of MSLN-CAR construct
3. 体外细胞实验，测试抗肿瘤效果及可能机制
通过IsoCode单细胞分泌蛋白组芯片分析，检测细胞因子分泌能力及细胞多功能性；
4. 动物模型实验，体内验证肿瘤抑制效果
体内治疗的异种移植小鼠模型，检测肿瘤抑制效果，并分析DiR免疫细胞的驻留和分布。
IsoCode单细胞分泌蛋白组分析
制备的CAR-UNKT细胞抗肿瘤效果如何？为什么CAR-UNKT表现出比CAR-T更强的杀伤癌细胞活性？作者通过IsoCode单细胞分泌蛋白组芯片系列中针对自然杀伤细胞的Human Natural Killer芯片（Fig.3）检测了免疫细胞分泌因子谱，并分析了细胞多功能性。
Fig. 3. The validated 32-plex panel consisted of five groups of cytokines: effector, stimulatory, chemoattractive, regulatory and inflammatory.
与MSLN高表达的SKOV-3细胞共培养刺激2.5h后，对照组T细胞表现出非常低水平的多功能性，CAR-T、UNKT和CAR-UNKT多功能细胞比例显著增加，CAR-UNKT具有最高的多功能细胞比例 (Fig.4)。
Fig. 4. Percentage of multifunctional T, CAR-T, UNKT and CAR-UNKT cells
为了进一步了解CAR-UNKT细胞的多功能性，结合多功能细胞比例和其细胞因子信号强度定义PSI（细胞多功能指数）值及各组因子对样本整体多功能性的贡献。对比发现，CAR-UNKT细胞的PSI显著高于CAR-T和UNKT细胞 (Fig.5)。
Fig. 5. PSI was computed for T, CAR-T, UNKT and CAR-UNKT cells co-cultured with SKOV-3 cells
为了区分每个样本中的多功能亚群，使用多功能热图来显示主要的分泌功能亚群。与激活的CAR-T和UNKT细胞相比，CAR-UNKT细胞被SKOV-3靶细胞刺激后表达穿孔素和颗粒酶B的频率和效应性PSI最高，这表明CAR-UNKT细胞可以通过穿孔素/颗粒酶B介导的凋亡途径中诱导更强的信号来裂解更多的肿瘤细胞 (Fig.6)。
Fig. 6. Polyfunctional heat map displaying major functional cytokines secreted across T, CAR-T, UNKT and CAR-UNKT cells upon SKOV-3 cells stimulation.
CAR-T细胞治疗的主要副作用是细胞因子释放综合征（CRS）。其中，IL-6是在CRS中起主要作用的细胞因子。由图5和6可见，与CAR-T相比，CAR-UNKT细胞产生的IL-6分泌频率和炎症PSI指数显著减少，分泌较少的IL-6并没有削弱其抗肿瘤能力，因此，可以使用更少的免疫细胞来实现卓越的肿瘤抑制效果，并大大减少导致CRS的细胞因子的产生。
综上，本研究提出了一种新的、强大的CAR-UNKT抗癌疗法，它结合了适应性免疫和先天免疫的特点。MSLN-靶向CAR-UNKT细胞可以非常有效地介导肿瘤细胞杀伤，并有望治疗MSLN-阳性癌症，如卵巢和乳腺癌等，为肿瘤免疫治疗提供了一种吸引人的替代疗法。IsoCode单细胞分泌蛋白组分析给研究者提供了对改造的细胞治疗产品进行临床前功能研究和效能评估的重要工具。
参考文献：
Wei Jiang, Guosheng Gu, et al. Novel mesothelin-targeted chimeric antigen receptor-modified UNKT cells are highly effective in inhibiting tumor progression. Pharmacological Research, Volume 197, November 2023. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2023.106942
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