默新探——提升AAV载体生产效率的创新之路：应对细胞裂解与DNA消化的关键挑战

表面活性剂的安全性问题：常用的细胞裂解表面活性剂TRITON™ X-100（4-叔辛基苯酚聚氧乙烯醚）的降解产物可能影响人体内分泌系统，甚至导致遗传突变，因此被认为对患者和环境构成潜在危害。截至2021年1月，TRITON™ X-100已被列入REACH（化学品注册、评估、授权和限制）清单中，欧洲委员会也已禁止该物质在欧盟内未经授权的使用。

表面活性剂兼容性与去除：在选择细胞裂解表面活性剂时，需考虑其对病毒载体及病毒颗粒感染性的影响，并确保其不会干扰后续流程。例如，常用的表面活性剂聚山梨醇酯可能会导致这种干扰。此外，所选表面活性剂还应易于在后续工作流程中去除和检测。

市场上存在多种类别的表面活性剂，表面活性剂分子本身可以是离子型、非离子型或两性离子型。凭借对洗涤剂领域的深入了解，默克筛选了30多种洗涤剂分子以寻找Triton™ X-100的最佳替代品，Deviron^® C16和Deviron^®13-S9是我们最终寻得的两款“可生物降解”的更环保更安全的同类最佳产品。

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图1. 裂解后存活细胞的百分比。该值是根据Vi-CELL（(Beckmann Coulter)）计数的总细胞和存活细胞计算得出的。两款Deviron^®表面活性剂在细胞裂解方面的效果与基准Triton™ X-100和Tween™ 20相当，甚至更好

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图2. 使用数字PCR测量的病毒基因组滴度。不同表面活性剂的病毒基因组滴度相当

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图3. 使用不同表面活性剂对HEK293贴壁细胞进行裂解后，AAV的感染性。感染性通过转导单位测定法进行评估。结果显示Deviron^®系列也可以保护AAV的感染性

Deviron^® C16去除研究的结果：

Deviron^® 13-S9去除研究的结果：

为探讨较高盐浓度对细胞裂解过程的影响，研究人员使用HEK293细胞生产AAV5载体，并采用TRITON™ X-100、聚山梨酯20、Deviron^® C16或Deviron^® 13-S9进行裂解。基线缓冲液条件为150mM NaCl和聚山梨酯20。结果显示，使用500mM盐的裂解缓冲液时，AAV5衣壳滴度平均增加了29%（见图4）。

图4：高盐裂解对生产AAV5的滴度的影响

为了测量500mM NaCl条件对AAV感染滴度的影响，研究人员使用HEK293细胞生产AAV5载体，并采用TRITON™ X-100、聚山梨酯20、Deviron^® C16或Deviron^® 13-S9进行细胞裂解。基线缓冲液条件为150mM NaCl和聚山梨酯20。当盐浓度增加至500mM并使用不同的表面活性剂时，感染力至少提高了10倍（见图5）。此外，研究还发现，在裂解过程中使用高盐浓度有助于减少AAV的聚集。

图5：高盐裂解对AAV2感染滴度的影响

在高盐浓度环境中进行DNA消化时，AAV载体颗粒的数量和感染滴度显著增加，同时减少了AAV的聚集。然而，传统核酸内切酶在此条件下的兼容性较差。高离子强度会阻碍酶与DNA之间的相互作用，抑制细胞裂解后DNA的消化过程。

图6：传统内切酶在高盐浓度下酶切活性下降

为了满足对高盐浓度兼容内切酶的需求，默克利用先进的蛋白质工程技术开发了耐盐型Benzonase^®。以IPEC PQG GMP和Emprove^® Expert形式发布。这种非动物来源的内切酶能够在高达1000mM的盐浓度下有效消化DNA和RNA。耐盐型Benzonase^®通过细菌表达系统生产，确保不含翻译后修饰，从而能够精确定义分子质量，并保证批次间的一致性和可重复性。相较之下，酵母中表达的酶通常存在不同程度的翻译后修饰，导致分子量不确定，从而影响批间稳定性。

图7. 还原SDS-PAGE显示耐盐型Benzonase^®内切酶（右）和竞争者A（左）的表征与纯度

图8. 非还原SDS-PAGE显示耐盐型Benzonase^®内切酶和竞争者A的表征与纯度

内切酶的活性依赖于镁离子。图9提供了耐盐型Benzonase^®（STB）与非耐盐核酸酶（SE）在不同镁浓度下的活性比较。STB的活性在高盐浓度下得到了增强，并且在1-10mM Mg²⁺和500mM盐的范围内保持稳定。在150mM和500mM盐条件下，STB的活性与SE在10mM Mg²⁺下的活性相似（见图10）。

图9. Benzonase^®耐盐型内切酶与非耐盐型内切酶活性的比较

图10. Benzonase^®耐盐型内切酶与非耐盐型内切酶活性的比较

图11显示了一项研究的结果，该研究使用STB以及其他市售的耐盐和非盐耐型内切酶，在500mM和1M NaCl条件下，于37°C消化DNA一小时。STB在500mM和1M盐浓度下完全消化了DNA，并表现出与耐盐型内切酶（Comp A）相似或更好的性能。

图11. 在37°C下，耐盐型Benzonase^®与其他市售的耐盐（Comp A）和非耐盐型（SE）内切酶，进行DNA消化的比较，消化时间为一小时

图12. 在37°C下，使用耐盐型Benzonase^®消化30分钟后，得到的DNA片段大小为25 U/ml

在与四种用于细胞裂解的不同表面活性剂结合使用时，评估盐耐型Benzonase^®的活性：TRITON™ X-100、聚山梨酯20，以及为应对TRITON™ X-100禁令而开发的两种替代表面活性剂——Deviron^® C16和13-S9。如图13所示，盐耐型Benzonase^®的活性未受到这四种表面活性剂的影响。在500mM NaCl裂解缓冲液中，存在TRITON™ X-100、聚山梨酯20和Deviron^® 13-S9时，DNA被完全消化（见图14）。

图13. 耐盐型Benzonase^®与不同表面活性剂组合使用时的活性

图14. 耐盐型Benzonase^®与不同表面活性剂组合使用时对DNA的消化效果

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“Benzonase^®耐盐内切酶 Emprove^®·Expert”数据表

技术海报·“使用高盐裂解和 Benzonase^®盐耐受内切酶的 AAV 工艺强化”

Deviron^®洗涤剂产品组合手册·“探索生物制药应用中 Triton^TM·X-100 的更环保替代品”

参考文献：

1.2020. Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs). [Internet]. U.S. Drug & Food Administration. Available from: 

https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigational-new-drug