粒细胞单细胞测序分析能做了！

基于前期队列研究发现，TANs在PDAC中大量浸润，且与PDAC患者预后不良相关。利用单细胞测序，研究者共检测到33891个外周血中性粒细胞和17932个胰腺癌免疫细胞的转录组，进一步划分8种细胞类型，其中中性粒细胞存在两个细胞群体：Neutrophils1存在于外周血样本，Neutrophils2仅存在于肿瘤组织中。CellphoneDB分析发现，相较于其他的免疫细胞，巨噬细胞与TANs间存在大量的配受体关系对，如CCL13-CCR1,CCL3-CCR1等，表明肿瘤微环境中两种细胞间的紧密相互作用，这也与免疫荧光染色中TANs和巨噬细胞间的物理距离接近的结果相互印证。

为了进一步研究中性粒细胞的异质性，烈冰为研究者提供了subCluster分析，对PDAC患者的中性粒细胞细分，获得了6个PMN亚群和6个TAN亚群，PMNs表现出相似的表达特征，而TANs存在异质性：TAN-1亚群高表达血管生成因子VEGFA、促转移因子PLAU、LGALS3等，表现为促癌的特征；TAN-2与炎症相关（表达NLRP3、CD69和IL1RN等基因）；TAN-3的基因表达特征和PMNs类似且高表达与中性粒细胞跨内皮迁移相关的基因（VNN2和SELL），说明TAN-3可能是迁移到肿瘤微环境中的过渡态细胞；而TAN-4特征性地高表达干扰素刺激基因。

鉴于TAN-3的过渡态特征，研究者应用monocle2算法进一步构建了中性粒细胞状态轨迹的伪时间图，以PMN为分化的起点，逐渐转化为TAN-3过渡态，随后经过TAN-0和TAN-4的状态，最后达到终末分化状态TAN-2和TAN-1。研究者找到了1757个随拟时轴显著变化的基因并可归类为3种表达模式，其中第3组基因在肿瘤微环境晚期被激活，并在缺氧、糖酵解、内质网（ER）应激、IL-1和TNF信号通路等过程富集。进一步，研究者利用ER应激诱导剂（毒胡萝卜素 (THG)、促炎细胞因子IL-1β和TNFα以及缺氧的方式，体外刺激了中性粒细胞样分化的HL-60（dHL-60）细胞，发现内质网应激和缺氧是诱导中性粒细胞向TAN-1表型分化的关键因子。

此外，免疫荧光和免疫组化染色证实在PDAC微环境中存在上述4个亚群。有趣的是，VEGFA+ TANs（TAN-1）通常位于癌细胞附近，使其能够发挥促肿瘤功能，结合多个临床数据的进一步分析显示，VEGFA+ TANs和PDAC患者的不良预后显著相关。

考虑到代谢状态与免疫细胞的表型、功能息息相关，研究人员进一步分析中性粒细胞的代谢特征，并发现与其他中性粒细胞亚群相比，糖酵解和缺氧在TAN-1亚群中显著上调；流式细胞分选的LGALS3+ TAN（TAN-1）细胞中，葡萄糖转运蛋白GLUT1和糖酵解酶HK2、PFKFB3和LDHA的表达上调。为了进一步探索TANs代谢特征的空间分布规律，结合空间转录组测序技术，研究者发现相比于间质区，肿瘤和癌旁区域的中性粒细胞糖酵解活性显著上调，此外转录组测序、蛋白组和代谢组的多重分析均证实了相较于外周血PMN，TAN中糖酵解途径的显著富集。

那么糖酵解途径和TANs的促肿瘤功能有什么关联呢？基于LDHA是糖酵解途径的关键酶，也是TAN-1的关键标志基因，团队通过体外实验分析了过表达LDHA的dHL-60细胞的功能特征，结果显示过表达LDHA可使dHL60细胞促进肿瘤细胞生长、抑制T细胞免疫应答。

进一步，研究团队通过SCENIC软件分析驱动TANs异质性的上游转录因子，发现转录因子BHLHE40在TAN-1中显著表达，调控VEGFA、LGALS3、LDHA和BHLHE40等基因，促进中性粒细胞在肿瘤微环境中向促肿瘤的TAN-1表型分化。BHLHE40过表达和敲除后，受其调节的上述基因的表达量也呈现相应的上调或下调，说明BHLHE40是中性粒细胞向TAN-1表型极化的关键调节因子，染色质免疫沉淀实验也证实了BHLHE40对促肿瘤基因的直接转录调节作用。

此外，过表达BHLHE40的dHL-60细胞和PDAC癌细胞共培养后，癌细胞的增殖和迁移能力显著增强。免疫学实验显示，BHLHE40过表达抑制了CD8+ T细胞产生促炎细胞因子及淋巴细胞的增殖能力， BHLHE40+中性粒细胞的高浸润也与PDAC不良预后相关，说明BHLHE40是驱动中性粒细胞向促肿瘤和免疫抑制亚型分化的关键调控因子。

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