建立自动化、高通量淘洗和筛选噬菌体抗体库的方法

建立自动化、高通量淘洗和筛选噬菌体抗体库的方法

       为了充分利用噬菌体库以及获得尽可能多样的新抗体，人们常同时进行多组抗原的筛选。在这本实验中，我们使用Thermo Scientific Kingfisher 磁珠纯化系统自动化选择和筛选程序，从VTT人类单链抗体(ScFv)文库(108)中平行筛选12种半抗原的特异性抗体。由于我们的自动化方式十分灵活、可靠，可以根据所用抗原的特性来优化筛选条件。

       将编码抗体的外源DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合后，以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面。导入了各种各样抗体基因的一群噬菌体，就构成一个展示各种各样抗体的噬菌体抗体库。用抗原去筛查噬菌体抗体库时，抗原会选择性地同与其有相互作用的抗体相结合，从而分离出展示该抗体的某个特定的噬菌体（下文称阳性噬菌体），可通过测序和ELISA作进一步鉴定。此技术常用于新型疫苗及药物的开发研究等方面。
      为了提高阳性噬菌体的百分比，又常需要进行多轮淘洗和筛选。在高通量淘洗和筛选噬菌体抗体库时，手工法往往耗费大量人力和时间。

        12种理化性质不同的半抗原，通过与载体蛋白AP或HAS的交联，成为能被抗体识别的全抗原。将抗原包被磁珠后与噬菌体抗体库孵育，抗原特异性的结合特定的抗体到磁珠上，随后通过磁棒将磁珠转移到洗涤液PBST中洗去非特异性结合的抗体，并重复洗涤步骤，最后在酸中洗脱得到阳性噬菌体。该过程称为淘洗和筛选，使用KingFisher Flex，一次可以进行96个样品的淘洗和筛选，得到的阳性噬菌体可通过感染大肠杆菌获得扩增后重复上述步骤从而富集阳性噬菌体。

图1.使用KingFisher自动磁珠纯化系统的筛选流程：包被抗原的磁珠和噬菌体孵育(黄色)后转移到清洗液(PBST，黄色)，结合的噬菌体用酸(红色)洗脱下来，中和之后用于感染新的噬菌体。

        得到的阳性噬菌体通过酶联免疫吸附检验（ELISA）进行分析，得到阳性结果的单克隆被选出进行进一步鉴定。通过半抗原-HAS和单独HAS的比较ELISA，去除结合到载体蛋白上的抗体。使用DNA测序分析阳性克隆的序列变化。最后使用竞争性ELISA检测进行亲和性排序。